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幸存者的战争:12天,看一部耐药菌的演化史

  大肠杆菌开拓记

大约两分钟前,我空降在了一片未被开发过的区域。这片区域看起来有着相当丰富的营养,尽管有阻力,但我还可以向周围运动。这看上去是个繁殖的好地方。我是一个大肠杆菌(Escherichia coli),大概20分钟后,我将会有第一代后代,而它还会进一步产生更多的“我”——有的时候,我们长得不完全一样,但毕竟也是我的子孙嘛。相信很快我们就能占领这片区域。

44个小时过去,这片地方已经全是我和我的后代们的了。那些去得比较远的先行者告诉我,远方还有未经开发的区域,但是那片区域似乎被什么东西污染了,它们感到很难受。可如果只在这里呆下去,营养也会被用完的。我的后代们必须做出觉悟。

现在,距离刚来的时候已经88个小时,那个有毒的区域还是被新的后代适应了!它们跟老家的先辈们比起来更不一样了。后来的一部分小家伙看上去具有更高的耐性,但早被勇敢的先行者们堵在了后面,这个问题看上去很难解决。先要加把劲占领这里再说吧。

第132小时,上一片区域也被占满了。我们不得不来到新的地方——地方很大,但也更加危险。不过我们已经有了应对的经验,就这么繁殖下去,反正总会有个别新家伙有办法适应。这不,我们来了。

第176小时,我们似乎陷入了绝境。许多先行者死在了更远的区域,为什么会这样?那片区域的污染太严重了,可脚下这个区域的营养已将耗尽了!它无法再容纳我的后代了!该怎么办?

没想到终于还是到达了这个被重度污染的区域!第220个小时,天知道我对自己的身体做了什么。我感觉到自己显然没有之前那么健康了。我的同行者更少了,身边大部分同类都死于这些该死的污染。但我还活着,相信它们也会想到办法跨过这道坎。我们还能制造更多的后代。

哈哈,早已大不相同的我和我的后代们终究还是在这片地方兴盛了起来。现在是第264个小时,这里的毒素对我们来讲已经不再是任何问题。少部分先行者已经到达了更远、含有更高浓度毒素的区域,依然有许多同类在死去。可那又怎么样?等着吧,我们一定能征服那片区域的。

培养板上的演化之路

上面这个大肠杆菌的故事,发生在哈佛医学院罗伊·契肖尼(Roy Kishony)“平板演化”实验上。在不足两周的时间中,它演化出了耐受高浓度抗生素的能力。在受到耐药菌威胁的今天,科学家正在两个方面进行努力——一部分科学家在尝试研发更多的抗菌药物;而另一部分科学家,包括契肖尼,则在试图搞清楚这些生物的能力究竟是怎么来的。根据契肖尼和同事在《科学》上发表的文章,大肠杆菌从普通病原到抗药性极强的细菌的转变,只需要12天的时间。

大肠杆菌所处那片广袤而受到不同程度污染的“土地”,是契肖尼和他的小组为了模拟微生物适应演化,设计的一个“软平板”。他们把这个装置称为“微生物演化与成长板”(microbial evolution and growth arena,MEGA)。这块体积达到了120×60厘米的巨型培养板由两层琼脂培养基构成。位于下层的培养基固体,成分不会自动扩散,因此研究人员可以按照自己的需求设置不同的抗生素浓度形成梯度。而位于上层的软琼脂培养基使得细菌不会像在正常的固体培养基上被“固定”成一个一个菌落,它们能够沿着这块板进行游动,扩散到它们能够生存的区域。契肖尼在整块下层琼脂平板上注入了黑色的墨水。大肠杆菌在形成菌落时会盖住下方墨水的颜色,这样,研究人员就能够直观地看到它们最终能走到哪里。

契肖尼的MEGA板。图中这一块是用于观察甲氧苄啶(TMP)适应进化的MEGA板,在MEGA板两侧添加的大肠杆菌将扩散到MEGA板中央含有高浓度TMP的区域。图片来源:参考文献[1]

契肖尼准备了两套这样的“竞技场”。除了两段的接种区,“竞技场”的其他区域分别含有不同浓度的甲氧苄啶(Trimethoprim,TMP)和环丙沙星(Ciprofloxacin,CPR)两种常见的抗生素。在TMP板中,它们的最小浓度单位为3个最小抑菌浓度(MIC)——1个MIC的量,就能够抑制大肠杆菌的生长。而当大肠杆菌们成功适应了3MIC的梯度后,它们还将面临30/300/3000倍MIC的“高山”。而在CPR板中,这个数字有所减小,但如果要使子孙覆盖整个“竞技场”,大肠杆菌也最终需要征服高达2000MIC的浓度才行。

而结果你已经知道了:那些大肠杆菌不但适应了对它们来说极为致命的抗生素浓度,而且速度是惊人的——12天和15天,这是它们分别攻克TMP和CPR板最高抗生素浓度区所花的时间。

大肠杆菌(白)在TMP板上12天的培养过程。图片来源:参考文献[1]

而这实在是太快了。

超级抗性是怎样炼成的

为了弄清楚大肠杆菌快速演化的背后发生了什么,契肖尼在含有TMP的MEGA板上随机挑选出位于不同梯度的菌落进行基因组测序,来搞清楚这些适应性背后的机制。按照测序的结果,研究人员将“变异菌群”分为两组:含有超过60个基因突变的高突变组,以及基因突变不超过12个的低突变组。

在MEGA板上采集的样本会用于基因组测序。图片来源:参考文献[1]

在所有高突变组中,一个被称为dnaQ的基因都出现了变异。这一基因负责编码DNA聚合酶III,在DNA复制的校对中扮演着关键角色。dnaQ的失活意味着细菌的DNA的复制会变得错误百出。在没有抗生素压力的“和平年代”,这样的不稳定会为菌落的持续生长增添额外的负担。但此时此刻,更多的错误将意味着更多的可能性——包含那些能够适应抗生素的可能。这部分可能带给整个大肠杆菌群落更大的生存几率。然而,这样的大肠杆菌抵达最高抗生素浓度区域的时间与低突变组的菌大致相同,这让研究者将分析的焦点放在了低突变组。

在低突变组中,一个名为folA的基因被反复突变掉。folA是二氢叶酸还原酶的编码基因,也是抗生素TMP作用的直接位点。这一基因的失活,可能将使得TMP无处着力。除了folA之外,一些与TMP抗性并无首要关联的基因也发生了突变。这其中包括与大肠杆菌应激反应相关的mar和sox,以及许多与TMP抗性相关的转录和翻译元件。

尽管这样的突变能赋予大肠杆菌更强的抗药性,但大部分时候,这都会以牺牲自己的生长速率为代价。在适应的初期,它们的生长速率会明显放缓。可即使这样一个短暂的“刹车”,也会对大肠杆菌造成巨大的影响。不过,在适应了筛选的环境后,细菌们又会找到办法回复之前的生长速度。MEGA板上空间有限,对于单个大肠杆菌菌落来说,复制一旦放缓,竞争者就会“超车”跑到它的前面。契肖尼发现,在抗生素梯度“边界”处的大肠杆菌,往往并非那些最能耐受抗生素的菌群。那些能够耐受最高浓度抗生素的菌群,往往会由于空间不足被硬“挤”在低浓度抗生素区——把这类“怀才不遇”的菌群移到抗生素浓度梯度的边界上,它们能够扩散更远的距离。

值得注意的是,尽管大肠杆菌在所展现的适应能力令人咋舌,但契肖尼和同事的其他实验,那些“一步登天”——能够直接从0跳到在最高浓度抗生素压力下存活的细菌并不存在,适宜的“中间浓度”也许是发生适应性进化的必要条件。

不同浓度设置下的TMP抗药性实验。t为培养时间。图片来源:参考文献[1]

MEGA板的存在使得人们得以在空间和时间两个维度来直观地观察细菌抗药性的演化史,这也促使人们进行思考未来如何更加有效地与之对抗。对抗生素和耐药菌之间关系的研究有很多,但人们很少意识到的是,在一个真实的环境中,演化程度并非决定种群密度的唯一优势。一些时常被人忽视的因素,比如复制速度和菌群密度,都可能成为耐药菌传播扩散的桎梏。借助更多这样的信息,科学家们也许能够发现更为恰当的对策应对耐药菌的威胁。

参考文献:Baym, Michael, et al. “Spatiotemporal microbial evolution on antibiotic landscapes.” Science 353.6304 (2016): 1147-1151.

文  科学人

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